Vilniaus universitetas

Proteomikos centras

Lietuvos biochemiku draugija


Orai Vilniuje

Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos  skyrius

Veikla

Mokslinių tyrimų kryptis – mikroorganizmų metabolizmo įvairovės tyrimas bei panaudojimas, kuriant naujomis savybėmis pasižyminčias ląsteles ir baltymus.

Nuo įkūrimo skyriaus moksliniai tyrimai buvo susiję su naujų prokariotinių fermentų paieška, identifikavimu ir konstravimu. Per paskutinį dešimtmetį molekulinės biologijos ir biochemijos progresas labai praplėtė fermentų pritaikymo ir kituose biotechnologiniuose procesuose galimybes. Nauji biokatalizatoriai vis plačiau naudojami įvairiose pramonės šakose, žemės ūkyje ir medicinoje. Baltymai tampa nanotechnologijų objektu. Sparčiai vystomi biokatalitiniai sintezės metodai organinėje chemijoje. Naujų fermentų paieška, jų modifikavimas ir naujų biokatalizatorių kūrimas tampa aktualia mokslinių tyrimų sritimi.
  Chinobaltymai – palyginus nauja oksidoreduktazių klasė, apimanti dehidrogenazes, turinčias chinoninės prigimties prostetines grupes. Didžiausią ir geriausiai apibūdintą chinobaltymų pogrupę sudaro baltymai, kurių sudėtyje yra kofaktorius pirolochinolino chinonas (PQQ) – 2,7,9-trikarboksi-1H-pirolo (2,3-f)chinolin-4,5-dionas. Chinobaltymai katalizuoja įvairių alkoholių, angliavandenių ir aminų oksidacijos reakcijas. Manoma, kad šie fermentai sudaro alternatyvią mažiau energijos generuojančią kvėpavimo grandinę. Pastaruoju metu nuo PQQ priklausomos dehidrogenazės pradėtos taikyti kuriant amperometrinius biojutiklius.
  Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyriuje nuo PQQ priklausomos gliukozės dehidrogenazės buvo išskirtos iš Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter sp. bei Erwinia sp. mikroorganizmų. Iš Acinetobacter genties mikroorganizmų buvo išgryninta, apibūdinta 12 nuo PQQ priklausomų bei naujomis savybėmis pasižyminčių gliukozės dehidrogenazių, nustatytos šiuos fermentus koduojančių genų sekos. Fermentų išeigą pavyko padidinti, klonuojant genus ir įvedant juos į E. coli ląsteles (bendradarbiaujant su Bayer AG, Meissner ir kt., 2004). Iš E. coli rekombinantinio kamieno išskirtas fermentas katalizuoja aldozių oksidaciją. Iki šiol pagrindinė tokių gliukozės dehidrogenazių panaudojimo sritis buvo biojutiklių kūrimas (Laurinavičius ir kt. 2001, 2002; Razumienė ir kt., 2003). Turint omenyje šių fermentų substratų spektrą, katalitines savybes ir galimybę genetiškai manipuliuoti, gliukozės dehidrogenazės yra labai perspektyvios, kuriant biokatalitinius angliavandenių oksidacijos procesus bei sintetinant naujomis savybėmis pasižyminčias medžiagas. Pirmą kartą buvo ištirti PQQ kofaktoriaus biosintezės ypatumai Erwinia ir Gluconobacter mikroorganizmuose, produkuojančiuose nuo šio kofaktoriaus priklausomas dehidrogenazes. Gauti rezultatai leido optimizuoti bakterijų kultivavimo sąlygas (Marcinkevičienė ir kt., 2002).
  Skyriuje yra tiriamos nuo PQQ priklausomos alkoholių dehidrogenazės iš Gluconobacter sp. 33 ir Pseudomonas putida HK5 ląstelių. Bendradarbiaujant su Yamaguchi universiteto (Japonija) mokslininkais nustatyta, kad alkoholių dehidrogenazė iš Pseudomonas putida HK5 IIG gali panaudoti ciklinius alkoholius kaip substratą, bet egzistuoja griežta priklausomybė tarp fermento aktyvumo ir substrato struktūros: a) monohidroksiliai cikliniai angliavandeniliai yra geri substratai; b) cikliniai cis- dioliai nėra substratai; c) cikliniai trans-dioliai yra blogi substratai ir jų oksidacija priklauso nuo enantiomerinės formos; d) monocikliai dioliai, kuriuose hidroksigrupės yra atskirtos bent viena metilengrupe yra geri substratai; e) bicikliai alkoholiai nėra (arba yra blogi) substratai. Taip pat buvo nustatyta, kad fermentas nevienodai efektyviai oksiduoja enantiomerines antrinių alifatinių alkoholių formas (Bachmatova ir kt., 2004, 2006). Dėl savo sugebėjimo efektyviai perduoti elektronus sintetiniams mediatoriams bei tiesiogiai elektrodams, abi alkoholių dehidrogenazės tinka biojutiklių kūrimui. Pastaruoju metu, siekiant pritaikyti nanotechnologijų bei funkcinių medžiagų specifines savybes įvairių ateities jutiklių, skirtų žmogaus sveikatos bei jo aplinkos monitoringui, ypač daug dėmesio yra skiriama bionanotechnologijoms. Bendradarbiaujant su Puslaidininkių fizikos institutu (Lietuva) parodyta, kad alkoholių dehidrogenazės gali būti panaudojamos, kuriant fermento-metalo sandūras, kurios pasižymi unikaliomis elektrinėmis savybėmis (Šetkus ir kt. 2002; Galdikas ir kt., 2002; Šetkus ir kt., 2003). Tokie rezultatai įgalino kurti planarines mikroelektromechanines struktūras, pvz., naujo tipo jutiklių konstravimui (Šetkus ir kt. 2004).
 Dar vienas nuo PQQ priklausomas fermentas – glicerolio dehidrogenazė – buvo aptiktas ir išgrynintas iš Gluconobacter sp. 33 ląstelių.Tai mono- ir polialkoholius oksiduojantis membraninis fermentas, kurį taip pat galima panaudoti biojutiklių kūrimui (Lapėnaitė ir kt., 2005).
  Kita didelė oksidacinių fermentų grupė – tai įvairios flavininės oksidoreduktazės. Buvo atlikti Arthrobacter sp. 1-IN sintetinamos heterotetramerinės flavininės sarkozino (N-metilglicino) oksidazės ir Arthrobacter globiformis sintetinamos flavininės N,N-dimetilglicino oksidazzės (DMGO) (pirmą kartą prokariotuose aptikto fermento) tyrimai. Baltymų produkcijai buvo sukonstruoti rekombinantiniai Escherichia coli kamienai, turintys šių baltymų genus. Tai leido išgryninti didelius (>100 mg) baltymų kiekius ir, bendradarbiaujant su Lesterio universiteto (Didžioji Britanija) mokslininkais detaliai ištirti šių fermentų savybes (Harris ir kt. 2000; Basran ir kt., 2002).
  Vykdant naujų fermentų, tinkamų biojutiklių kūrimui, atranką, buvo išskirtas Enterococcus genties bakterinis kamienas – RL1 – priklausantis mundtii- casseliflavus-flavescens enterokokų grupei ir gaminantis L-a-glicerolio fosfato bei laktato oksidazes. Vandenilio peroksidą produkuojančios laktato ir glicerolfosfato oksidazės buvo išgrynintos, charakterizuotos bei panaudotos biojutiklių konstravimui (Garjonyte ir kt., 2001).
  Prokariotų metabolizmo tyrimas – dar viena skyriuje atliekamų tyrimų sritis. Biodegradacijos procesų tyrimai yra viena iš galimybių aptikti ir kurti naujus fermentus. Pramonės poveikyje biosferoje atsirado daugybė naujų cheminių junginių, kurie anksčiau natūraliuose medžiagų apytakos cikluose nebuvo sutinkami. Dėl sugebėjimo prisitaikyti prie kintančių aplinkos sąlygų, atsirado mikroorganizmų, sugebančių ksenobiotikus panaudoti kaip energijos ir maisto medžiagų šaltinį. Pastoviai evoliucionuojantys biodegradacijos procesai sudaro sąlygas formuotis naujiems fermentiniams aktyvumams. Darbo metu buvo išskirta ir identifikuota daugiau kaip 80 naujų bakterijų, skaidančių piridiną, piraziną bei jų metilintus, karboksilintus ar hidroksilintus darinius. Nustatyta, kad dauguma išskirtų mikroorganizmų priklauso Arthrobacter, Corynebacterium bei Rhodococcus gentims. Tiriami šių junginių skaidyme dalyvaujantys fermentai ir juos koduojantys genai. Nustatyta, kad ankstyvuose 2-hidroksipiridino biodegradacijos etapuose Arthrobacter spp. ir Rhodococcus spp. bakterijose veikia skirtingos fermentinės sistemos. Parodyta, kad 2-hidroksipiridino hidroksilinimo reakciją katalizuoja dviejų fermentų – FMN reduktazės ir 2-hidroksipiridino 5-monooksigenazės – kompleksas. Toks fermentinis aktyvumas buvo aptiktas pirmą kartą (Semėnaitė ir kt., 2003; Gasparavičiūtė ir kt., 2004, 2006). Tiriant 2-hidroksipiridiną skaidančius Rhodococcus genties mikroorganizmus ir panaudojant specifinius oligonukleotidinius pradmenis, buvo identifikuoti šį metabolinį kelią koduojantys genai. Sukaupta didelė eksperimentinio darbo patirtis ir bakterijų kolekcija bei sukurta tyrimų bazė, įgalinanti toliau plėtoti biodegradacijos tyrimus.
  Glicino betainas (N,N,N-trimetilglicinas) atlieka svarbų vaidmenį osmoreguliacijoje – jis apsaugo ląsteles nuo osmosinio streso. Šis procesas ištirtas tiek mikro-, tiek ir makroorganizmuose, tačiau nedaug buvo žinoma apie glicino betaino ir kitų osmoprotektorių likimą po to, kai osmosinis stresas nustoja veikti. Nemaža mikroorganizmų dalis, gyvenančių aplinkoje, kurioje osmosinio slėgio svyravimai yra dažni, gali naudoti šiuos junginius kaip energijos, anglies ir azoto šaltinius, tačiau glicino betaino katabolizmo keliai ir juose dalyvaujantys fermentai buvo mažai tirti.
 Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyriuje buvo tiriamas glicino betaino katabolizmas Arthrobacter genties bakterijose. Panaudojus darbo metu sukurtus atrankos metodus, pirmą kartą iš Arthrobacter mikroorganizmų klonuoti heterotetramerinę N-metilglicino (sarkozino) oksidazę ir prokariotinę N,N-dimetilglicino oksidazę koduojantys genai (Meskys ir kt., 2001). Nustatyta dimetilglicino oksidazės operono nukleotidų seka parodė, kad dimetilglicino oksidacijos metu atsirandančios metilgrupės gali būti perduotos į C1 kelią, t. y. glicino betaino metilgrupių likimas priklauso nuo augimo sąlygų – C1 fragmentai gali būti nukreipti į aminorūgščių arba purino biosintezę, arba gali būti utilizuoti NADH kvėpavimo grandinėje. „Smeigtuko“ buvimas tiek už sox, tiek už dmg genų rodo, kad skirtingos operono vietos yra reguliuojamos skirtingai (Časaitė ir kt., 2003, 2004, 2006). Remiantis sarkozino ir dimetilglicino oksidazių operonų struktūromis, pirmą kartą buvo pasiūlytas galimas glicino betaino katabolizmo kelias Arthrobacter genties bakterijose.